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ATP-生物荧光法在筛选卵巢癌化疗药物中的应用

2012-7-6 17:30 浏览次数:600 我来说两句(0)
论文导读:荧光素-荧光素酶系统热稳定性在37℃条件下,液态和冻干的荧光素-荧光素酶活性残留率.在37℃下,6h液态荧光素-荧光素酶活性下降至23.70%;而冻干的荧光素-荧光素酶在37℃下, 72h仍保持63.5%活性....  化学治疗是肿瘤治疗的重要手段之一.体外药物敏感性试验是实现个体化治疗,提高治疗效率的重要方法.三磷酸腺苷(ATP)是活细胞内基本能量单位,当细胞死亡时,胞内释放出的ATP酶能迅速水解ATP,因此测定细胞内源性ATP含量,可反映细胞活性和活细胞的数量.
  将手术获得肿瘤细胞体外给药培养,应用ATP-生物荧光法检测ATP含量可反映药物对肿瘤细胞的杀伤作用.本文以人卵巢癌细胞株A2780为实验模型,对ATP-生物荧光法实验条件进行优化,采用该方法对34例卵巢癌标本,进行了肿瘤化疗药物的体外筛选.
  材料和方法.材料.细胞系及标本 人卵巢癌细胞株A2780,常规方法培养(RPMI 1640培养基).34例新鲜卵巢癌手术标本,由中国医学科学院肿瘤医院提供.
  主要试剂.改良RPMI 1640培养基,由北京金紫晶生物技术有限公司提供; ATP标准品、Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶,由Gibco公司提供;荧光素和荧光素酶(用前分装冻干),由Promega公司提供;三氯醋酸由Sigma公司提供.
  化疗用药.卡铂(CBP)、紫杉醇(TXL)、足叶乙甙(VP16)、诺维本(NVB),临用前,用培养基配制.
  实验方法.卵巢癌组织分离.选取新鲜卵巢癌组织样本,在无菌条件下,剥离肿瘤组织的纤维、脂肪及结缔组织,然后用剪刀将标本剪成约1e3大小的碎块.
  卵巢癌单细胞悬液制备.加入10mL含0.2%Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶的培养基,于CO2孵育箱37℃孵育1.5-3h,每隔15-30min振荡一次,消化完全后,用160目筛网滤过,然后加入25mL培养基,混匀, 400g离心10min,弃上清,重复一次.若红细胞含量大于25%,需加入10mL预冷的红细胞裂解液破裂红细胞,混匀,离心.
  卵巢癌A2780细胞收集.首先用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化分散细胞,加入20mL培养基终止反应, 400g离心10min,弃上清,加3mL培养基,混匀.
  细胞计数.细胞消化后,经台盼蓝染色,计数活细胞数.
  给药培养.调整细胞至20-40万个/mL浓度,以每孔0.1mL接种至培养板.按400%、200%、100%、50%、25%和12.5%的血浆峰值浓度(PPC),将药物加入培养孔中,每个浓度设3个·152·Labeled Immunoassays & Clin Med, September 2003,Vol.10,No.3平行孔和对照孔.将培养板置于CO2孵育箱内(37℃,5%CO2,相对湿度大于95%)培养,每隔2-3天观察一次.
  ATP提取与测定.培养至第7天,取出培养板,加入50μL ATP提取液(含2%三氯乙酸),静置5min,然后吸取50μL上清液,加到对应含50μL荧光素-荧光素酶(0.05mol/L Tris-HCl, 10mmol/L MgSO4, pH 7.8)培养板内,振荡10s,立刻测定,计算出ATP含量.
  ATP标准曲线绘制.将250ng/mL ATP进行系列稀释(3倍),各取50μL,以同样条件测定ATP含量,绘制荧光强度(RLU)与ATP含量的对数坐标曲线.
  数据处理.计算50%肿瘤细胞生长受到抑制(IC50)时的血浆峰值浓度百分比.
  结果评价标准.体外判定标准为:耐药IC50大于25% PPC;敏感IC50小于25% PPC.体内判断标准为:敏感指临床完全缓解或部分缓解耐药:指临床未缓解.
  结果统计.利用SPSS软件进行统计分析.
  结果.荧光素-荧光素酶系统热稳定性在37℃条件下,液态和冻干的荧光素-荧光素酶活性残留率.在37℃下,6h液态荧光素-荧光素酶活性下降至23.70%;而冻干的荧光素-荧光素酶在37℃下, 72h仍保持63.5%活性.
  细胞生长曲线.A2780细胞和卵巢癌细胞生长曲线.A2780细胞生长状态良好,增殖迅速.卵巢癌新鲜组织,在第1-3天内,正常细胞大量死亡,肿瘤细胞生长良好.
  剂量-效应关系.卵巢癌细胞经抗癌药物处理后,药物浓度与卵巢癌细胞生长抑制率的剂量-效应曲线.可灵敏地反映出不同药物或同种药物不同浓度,对肿瘤细胞杀伤作用及联合用药与单药作用的差异.
  本研究同时表明ATP生物荧光技术在肿瘤药物敏感性检测中,具有敏感性好、重复性强、量程宽和快速简便等优点.最小可检出40个细胞,优于MTT法(需200个细胞);ATP浓度在0.11-250ng/mL范围内,与荧光强度呈良好线性相关,相关系数大于0.998(P<0.001);在2×104至4×105个细胞/孔,细胞数量与ATP荧光强度(4×102-106)呈线性相关,相关系数大于0.990(P<0.001).
  此外,改良RMPI1640培养基可选择性地促进肿瘤细胞生长,抑制非肿瘤细胞如成纤维细胞,使肿瘤细胞所占比率高于75%,更好地体现药物对肿瘤细胞的杀伤作用,可代替软琼脂培养基.
  初步的临床研究表明,卵巢癌体外药敏检测的标本可评价率为94%,灵敏度为90%,特异性为91.7%,均略高于有关报道.总之, ATP-生物荧光法是一种较为理想的药敏检测手段,可为临床开展肿瘤患者个体化治疗提供依据,但尚需增加临床标本量进一步研究.


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