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阿散酸在猪体内的药动学与生物利用度研究

2012-7-6 17:34 浏览次数:725 我来说两句(0)
论文导读:选用体重25 kg左右的长大二元杂健康猪8头,按双周期双交叉试验设计,进行静脉注射与内服阿散酸(10 mg/kg)的药动学研究。采用高效液相色谱法测定猪血浆中阿散酸的浓度,用统计矩原理处理血浆药物浓度-时间数据。 结果显示:健康猪静脉注射阿散酸后的主要药动学参...  选用体重25 kg左右的长×大二元杂健康猪8头,按双周期双交叉试验设计,进行静脉注射与内服阿散酸(10 mg/kg)的药动学研究。采用高效液相色谱法测定猪血浆中阿散酸的浓度,用统计矩原理处理血浆药物浓度-时间数据。
  结果显示:健康猪静脉注射阿散酸后的主要药动学参数为β=0.55 h±0.13 h,AUC=15.12μg/mL.h±0.01μg/mL.h,F=24.5%±3.4%。研究结果表明,阿散酸在健康猪体内的药动学特征为内服吸收迅速,血药浓度达峰时间短,但药物峰浓度低,绝对生物利用度低,消除快。
  阿散酸(arsanilic acid)属有机砷类饲料添加剂,美国FDA最早于1964年允许应用于鸡的饲料,1983年正式批准用作猪、鸡的促生长剂,我国农业部1996年批准有机砷制剂的使用。
  中国兽医科学散酸能有效控制仔猪腹泻、提高生产性能和降低料肉比。阿散酸可有效抑制肠道微生物如大肠杆菌、沙门氏菌等,使肠壁变薄,有利于营养物质的吸收与转运。此外还能促进机体色素的形成,使动物皮肤红润、被毛光亮。
  关于阿散酸在猪体内的药动学研究报道很少,国内未见相关报道。本研究旨在建立一种简便、准确可靠的猪血浆中阿散酸浓度的检测方法,探讨阿散酸在猪体内的药动学特征及生物利用度,为阿散酸应用后的残留监控、食品安全以及经排泄后的生态风险评估提供实际依据。
  材料与方法试验药品与试剂阿散酸对照品:含量99.0%,批号C10300250,由德国Dr.Ehrenstorfer公司提供。阿散酸原粉:含量99.6%,批号20091214,由广州惠华动物保健品公司提供。磷酸二氢钾:批号20061203-1,广州化学试剂厂生产。
  甲醇:色谱纯,德国Merck公司产品。三乙胺、甲酸、二氯甲烷均为分析纯试剂,由天津市大茂化学试剂厂生产。
  主要仪器高效液相色谱仪,Agilent HP1100型,配有四联泵、柱温箱、自动进样器、紫外检测器、色谱工作站,美国AGILENT公司产品。此外,试验用仪器还有德国Eppendorf 5804(R)型离心机、电子分析天平、微量混合器、超声清洗机、可调微量移液器等。
  实验动物8头长×大二元杂(Yorkshire×Landrance)健康猪,公母各半,70日龄,体重25.2 kg±1.3 kg,由广东省原种猪场提供。按常规饲养,自由饮水和采食,饲料为全价日料(不含任何有机砷添加剂和抗菌药物),试验前临床观察2周。
  给药和血样采集试验猪随机被分为2组,按双周期双交叉试验设计,进行静脉注射及内服阿散酸的药动学试验,2次试验间隔为1周,给药剂量均为10 mg/kg。给药前采1次空白血,静脉注射和内服(胃管灌胃)给药后分别于第5、15、30、45分钟以及第1、1.5、2、3、5、8、10、12、16和24小时采血,分离血浆,-20℃保存待测。
  血浆中阿散酸浓度的测定血浆样品预处理 样品经解冻摇匀,准确吸取0.5 mL加入1 mL甲醇-乙腈混合液(二者体积比为6∶4),涡旋振荡3 min,12 000 r/min离心15min,吸取全部上清液,在40℃水浴中N2流吹干。
  用流动相溶解残留物,加入0.2 mL二氯甲烷,涡旋振荡2 min,12 000 r/min离心10 min。吸取上清液至棕色进样瓶中进行HPLC分析。
  色谱条件 色谱柱ODS-2 HYPERSIL(250mm×4.6 mm,5μm);流动相:含5 mmol/L磷酸二氢钾、5 mmol/L四丁基溴化铵和1.4 mL/L三乙胺的水相-甲醇混合液(二者体积比为96∶4,pH=4.64);流速1 mL/min;柱温25℃;紫外检测波长为244 nm。
  数据分析处理采用WiNonLin5.2软件统计矩原理处理药时数据,计算有关的药动学参数,同时以血药浓度平均值对时间做药时曲线。
  结果:方法学考察阿散酸在0.05~50μg/mL浓度范围内,线性关系良好,回归方程为y=0.044 4x+0.000 5,r2=0.999 9;平均回收率为81.23%~85.75%;日内变异系数为2.50%~4.12%,日间变异系数为4.78%~5.89%。本方法检测限为0.015μg/mL,定量限为0.05μg/mL。
  药动学参数试验猪经单剂量静脉注射和内服阿散酸后,药时曲线见图1,主要药动学参数见表1。猪内服阿散酸吸收不充分,生物利用度F=24.5%±3.4%。
  讨论血浆中阿散酸HPLC检测方法的建立Aschbacher等研究阿散酸在猪、鸡体内代谢规律时用低压液相色谱-质谱联用检测猪和鸡体内标记过的阿散酸。Pérez-ruiz等用流动注射分析。
  Roerdink等根据溶液中的阿散酸与二甲氨苯基反应的原理,用连续流动分析仪定量分析了天然水中的阿散酸。由于阿散酸作为饲料添加剂和兽用药物的广泛使用,因此优先建立一种灵敏、快速的检测阿散酸的方法是十分必要的。本研究通过离子对高效液相色谱法,优化前处理,建立直接定量检测猪血浆中阿散酸的方法。
  本试验选择了不同溶剂提取阿散酸,如磷酸盐缓冲溶液、甲醇、乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷等,但是任何一种溶剂都不能有效萃取血浆中的药物。本方法采用甲醇-乙腈混合溶液进行萃取,既有很好的提取效果,又有利于蛋白沉淀。
  液相色谱系统中流动相的选择起着很关键的作用,它决定着目标分析物的分离及分离程度。
  在pH3~5之间,阿散酸与四丁基溴化铵能形成稳定的离子对,调节甲醇在流动相中的比例,在ODS柱上获得合适的保留。所以本试验采用5 mmol/L磷酸二氢钾(pH=4.64),并添加三乙胺作扫尾剂。
  阿散酸静脉注射给药的药动学特征健康猪静脉注射阿散酸(10 mg/kg)后,在体内分布迅速,表观分布容积Vz为0.30 L/kg,药时曲线下面积AUC为60.44μg/mL·h,半衰期短,t1/2β仅为1.26 h,表明阿散酸在猪体内分布不广泛,且消除迅速。平均滞留时间MRT为1.75 h,与消除迅速的结果相符。
  阿散酸内服给药的药代动力学特征健康猪内服阿散酸(10 mg/kg)后,吸收迅速,达峰时间为1.81 h,峰浓度为3.43μg/mL,消除半衰期t1/2β为1.79 h,平均滞留时间MRT为3.95 h,表明阿散酸内服在猪体内的滞留时间较短,体内消除较迅速。
  药时曲线下面积AUC仅为15. 12μg/mL.h,生物利用度F为24.5%,说明阿散酸内服吸收少,生物利用度低。这一结果与其他文献报道:阿散酸和洛克沙砷很少在鸡、猪组织中残留,大部分以原形排泄到体外基本一致。
  Over-by等报道与无机砷相比,阿散酸在鸡体内排泄更快,且在组织中残留更少。
  实际生产意义按10 mg/kg对猪灌服阿散酸溶液后,血药浓度迅速上升,灌服后第10 min血浆中阿散酸的浓度达到0.16μg/mL,第1.81小时就达到最高血药浓度3.43μg/mL。给药后第16小时的平均血药浓度仅为0.08μg/mL,第24小时或以后测不到阿散酸的血药浓度。表明阿散酸达峰时间短,消除迅速。
  畜禽饲养中内服使用阿散酸,如遵循正常的添加剂量(50~100 mg/kg)和休药期,其残留较小,与其他文献报道的相一致。但由于内服生物利用度低(仅为24.5%),畜禽长期添加饲喂阿散酸过程中,阿散酸势必以原形或以其他含砷代谢物大量经粪尿等排出体外,对环境生态造成危害进而通过食物链影响人类健康。因此,本研究结果为有机砷类添加剂应用后的生态风险评估研究提供了实际依据。


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